AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE MUTANTES DE Bradyrhizobium sp. (Phaseolus lunatus) RESISTENTES A ESTREPTOMICINA Y ESPECTINOMICINA S. León y D. Zúñiga

Introducción
La identificación y selección de cepas más eficientes de rizobios se ha llevado a cabo utilizando diferentes metodologías, llegando cada una de ellas a diferentes niveles de estabilidad. Dentro de estas, la resistencia intrínseca a antibióticos se utilizó por su fiabilidad a bajos niveles de antibiótico siendo esta una propiedad estable entre las cepas de rizobios, además que los resultados son reproducibles en un largo período (Kremer y Peterson, 1981) El objetivo de este trabajo fue determinar patrones de diferenciación de resistencia intrínseca, además evaluar las cepas mutantes resistentes obtenidas en un ensayo de laboratorio.

Metodología
Para la obtención de los mutantes se utilizó la cepa PLL113 de Bradyrhizobium sp., que infecta a Phaseolus lunatus (pallar). Esta fue cultivada en medio LM (levadura-manitol) según Vincent (1975), para su crecimiento y aislamiento. Para el crecimiento se cultivó la cepa en caldo LM a 28°C por 5 días, determinándose la concentración celular a través de diluciones múltiples en solución salina (0.85%). El aislamiento de los mutantes se realizó empleando sulfato de estreptomicina y espectinomicina en polvo. Se prepararon tubos con caldo LM con diferentes concentraciones (0 - 300 µg/mL) para ambos antibióticos, con el fin de hallar la concentración mínima inhibitoria (CMI). Por el método de diseminación (perlas) se sembró 0.1 mL del cultivo en placas con y sin antibiótico, incubándose a 28°C por 10 días, con tres repeticiones. La concentración de cada antibiótico fue diez veces superior a la CMI para asegurar así la obtención de cepas mutantes. Las colonias mutantes halladas fueron probadas nuevamente a la misma concentración de cada antibiótico. La efectividad e infectividad de las cepas en estudio fue determinada por la inoculación de semillas de Phaseolus lunatus variedad Ica-450. Los tratamientos incluidos fueron las cepas PLL113, PLL113 str, PLL113 spc y los controles N(+) (fuente nitrogenada KNO₃) y N(-) (sin fuente nitrogenada). La evaluación de la capacidad simbiótica se realizó por el criterio de Lalande et al. (1990) en efectividad por el peso seco de la parte aérea y la infectividad por el número y tamaño de nódulos.

Resultados y discusión
Se utilizó una población de 10⁹ ufc/mL para la cepa. La efectividad de las diferentes concentraciones de los antibióticos (Estreptomicina - Espectinomicina) frente a la cepa se aprecia en los gráficos 1 y 2, indicando un diferente comportamiento frente a los dos antibióticos.

Gráfico 1. Curva de acción de la estreptomicina frente a Bradyrhizobium sp. PLL113.

Gráfico 2. Curva de acción de la espectinomicina frente a Bradyrhizobium sp. PLL113.

Se obtuvieron cepas mutantes resistentes de ambos antibióticos en concentraciones mayores a la CMI, pero los mutantes que se encontraban en el rango de mutación de 1:10⁶ ufc/mL fueron de 50 y 250 µg/mL para estreptomicina y Espectinomicina respectivamente. Al evaluar las cepas a nivel de laboratorio se obtuvo una correlación entre el peso seco y el tamaño de la planta de r = 0.784, y entre el número y peso seco de nódulos de r = 0.897, apreciándose una eficiencia en la fijación simbiótica de todas las cepas (original - mutadas) evaluadas. Esto se asemeja a los resultados del CIAT (1988) en sus trabajos con frijol. Según el criterio de Lalande et al. (1990) se obtuvo que la PLL113str se comportó como muy efectiva y muy infectiva, en tanto la PLL113 y PLL113spc mostraron ser infectivas y efectivas, siendo las cepas superiores a los controles N(+) y N(-). Con estos resultados se aprecia que la cepa PLL113str supera a la cepa original en su capacidad de simbiosis. Además, todas las cepas superan a los controles N(+) y N(-).

Conclusiones
Los antibióticos (estreptomicina - espectinomicina) actuaron con patrones de susceptibilidad diferente en la cepa PLL113 de Bradyrhizobium sp. La cepa PLL113 al someterla a la acción de la estreptomicina elevó su potencial simbiótico a nivel de laboratorio, el cual puede ser utilizada como nueva alternativa en la fijación de nitrógeno.

Referencias

Kremer, J.R. y L.H. Peterson. 1981. Nodulation efficiency of legume inoculation as determined by intrinsic antibiotic resistance. Appl. Environ. Microbiol. 43.
Lalande, R., P. Bigwanesa y H. Antoun. 1990. Symbiotic effectiveness of strains of Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli isolated from soils of Rwanda. Plant Soil. 121: 41-46.
Vincent, J.M. 1975. Manual Práctico de Rhizobiología. Ed. Hemisferio Sur. Buenos Aires.